请教克隆
我有两个片段想链接一起，一个（vector）大概9.5kb，另外一个（insert）4kb.都是NotI酶切的.怎么就连不起来呢？连了快2个月了.有时候有克隆但是都不是positiv.请有经验的前辈帮忙.是不是加PEG6000增加粘稠度可以提高可能啊！ 你的vector用酶切了以后 是怎么纯化的呢？是用胶回收的kit么？9.5kb如果用kit回收很容易会吧粘端损坏掉（虽然说明书上说不会），还有酶切有没有过度？ 是先跑胶然后用kit，还用cip了，也曾经不用cip过，但是有negativ克隆，就是说vector自己连了，可是就是没有insert，气死了，到现在共挑了100多个克隆了，惨啊，，，，，， 对了，用的酶是NotI 载体酶切之后要去磷酸化了吗，否则肯定是载体自连的比较多了 首先你的连接我弄不明白为什么连不上，想问下你，你做了载体和insert的比较了吗，可以通过跑胶，取载体和insert 各0，5ul，1ul，2ul，然后比较下，他们的intensitaet，vector和insert在多少ul情况下相当，然后你的vector和insert大小都知道，最后的比例是10比1，计算出你要加的vector和insert的最佳量去连接，这样肯定没问题。再告诉你个方法，不用浪费时间挑那么多个Negativ klon，在你的Ligation之后，可以再选择一个酶，这个酶只切你vector不要的那段，不切vector你要的那段和你的insert，通过这次酶切，可以把没有你insert的vector排出，不至于最后没有posivtiv的klon，还要挑那么多，真累人。不知道说明白没，你去试验一下吧。 感觉楼主的问题很可能是DNA片断的质量不够好，可以试试跑CRYSTALVIOLET胶来纯化。 多谢各位帮忙，楼上crystalviolet胶没有做过，可以说详细些吗？
我的克隆其实很简单，就是vector用NotI切一下，就成线性DNA了，大概9.5KB，Insert，3.5kb是在Topo 里面，用NotI切一下后跑胶提取我想要的片段后两者一连接就可以了，非常非常简单滴，但是就是做不出来，是不是NotI不好连啊？
楼上的楼上是说ligation的产物再用酶切吗？然后把酶切后的产物transformation吧？可是ligationbuffer和酶的buffer肯定不兼容，如果再过柱的话是不是DNA太少了？
对了，我的vector是用过CIAP的了。
多谢大家了！ lz, 如果第一次失败，后面就要做negative control了。
如果negative control上的克龙跟你的ligation差不多多，那就没必要挑了。 有时候control上比较少些克隆啦，做了N次。是不是两个片段太大就不好连接啊？ 多谢各位帮忙，楼上crystalviolet胶没有做过，可以说详细些吗？
我的克隆其实很简单，就是vector用NotI切一下，就成线性DNA了，大概9.5KB，Insert，3.5kb是在Topo 里面，用NotI切一下后跑胶提取我想要的片段后两者一 ...
168 发表于 2009-8-29 21:00 http://www.dolc.de/forum/images/common/back.gif
对，Ligation后，要柱子纯化，然后再酶切，再纯化。损失这点不算什么，最后哪怕一个盘子上面长一个klon是对的，也算你成功了，不至于挑那么多Negativ的，你说呢！ 楼上说得对，就是这条用在我的克隆上不行的，因为，所有vector我都要的。不过还是要多谢你的tip，以后克隆可以用的。{:5_394:} 有时候control上比较少些克隆啦，做了N次。是不是两个片段太大就不好连接啊？
168 发表于 2009-8-30 05:30 http://www.dolc.de/forum/images/common/back.gif
楼主的这种情况的确不是很容易的克隆，因为片断比较大，连接反应用量要比较大的，不知道楼主有没有考虑这个问题。9.5KB的话，我估计一个10µl反应得用150ng. 关于CRYSTALVIOLET胶，如果楼主感兴趣，给我个短信，我可以把protocol发给你。 lz,negative control要做足，backbone的，insert的，甚至buffer的，如果问题不是在negative control里就赶早换strategy吧。克龙有时候要碰点运气的。一个克龙上就花2个月，你的进度得延后多少啊。 One of the possible reason might be that the PCR insert is not efficiently digested. Try to extend the the overhang to 10nt and NotI digestion for O.N.
Or, try to clone the insert into an intermediate vector, then re-clone to the target.
Good Luck! LZ纯化9.5kb的时候可以这样， 做一块0.8%的大胶，不加EB，然后把样品分成两份跑过夜，这样可以一定程度上分离开没有被切完的的vector（超螺旋等等），然后切一个泳道的胶下来放进EB incubate一段时间，在紫外下看看9.5kb的band在哪里，然后在胶上作一个记号，在把这块胶拿回去和没有EB的胶比对一下，把另外一个泳道的band根据你做的记号大概的切下来，这样做是为了不在你切胶的时候DNA被UV破坏，然后用原始的phenol法把DNA纯化出来，这样你会得到很纯的DNA，而且没有损伤，但是缺点是量比较小，所以要多准备一些样品，下面再进行正常的连接就行了。希望对你有帮助。 lz,negative control要做足，backbone的，insert的，甚至buffer的，如果问题不是在negative control里就赶早换strategy吧。克龙有时候要碰点运气的。一个克龙上就花2个月，你的进度得延后多少啊。
junhuaq 发表于 2009-8-30 12:48 http://www.dolc.de/forum/images/common/back.gif
我不止做了2个月了。{:4_300:} 看不懂你们在干什么啊，我匿了 LZ纯化9.5kb的时候可以这样， 做一块0.8%的大胶，不加EB，然后把样品分成两份跑过夜，这样可以一定程度上分离开没有被切完的的vector（超螺旋等等），然后切一个泳道的胶下来放进EB incubate一段时间，在紫外下看看9 ...
一两行 发表于 2009-8-30 17:44 http://www.dolc.de/forum/images/common/back.gif
这种方法可以代替CRYSTALVIOLET胶，目的都是保护大片段不受UV的损害。 Crystal violet 胶
Exposure to UV light may damage nucleic acids. Crystal violet does not require excitation by UV light and was therefore used to visualize large DNA fragments or long PCR products to be purified. The disadvantage of crystal violet is a much lower sensitivity compared with ethidium bromide. To be visible, a minimum 200 ng DNA is required. A white background helps to improve visibility. The final concentration of the stain, in the gel as well as in the running buffer, was 10 µg/ml.
基本步骤同一般的胶是一样的，但是使用结晶紫代替EB。
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